Caracterización antigénica

Los "antígenos" son estructuras moleculares que se encuentran en la superficie de los virus y el sistema inmunitario reconoce. Son capaces de desencadenar un tipo de respuesta inmunitaria conocida como producción de anticuerpos. Hay dos proteínas (hemaglutinina y neuraminidasa) en la superficie de los virus de la influenza que contienen los principales antígenos sobre los que actúan los anticuerpos (ver la Figura 1).

Cuando una persona queda expuesta a un virus de la influenza (ya sea por infección o a través de la vacunación), su sistema inmunitario produce anticuerpos específicos contra los antígenos (proteínas superficiales) de ese virus de la influenza en particular. El término "propiedades antigénicas" se usa para describir el anticuerpo o la respuesta inmunitaria desencadenada por los antígenos de un virus en particular. La "caracterización antigénica" hace referencia al análisis de las propiedades antigénicas del virus para conocer cuán relacionado está con otro virus.

Los CDC caracterizan antigénicamente unos 2 000 virus de la influenza a lo largo de una temporada de influenza típica, con el objetivo de monitorear los cambios en los virus en circulación y comparar las similitudes y diferencias entre estos virus y los que conforman las vacunas. La caracterización antigénica puede ofrecer un indicio sobre la capacidad que tiene la vacuna contra la influenza para producir una respuesta inmunitaria contra los virus de la influenza que circulan entre las personas. Esta información también ayuda a los expertos a decidir qué virus debería incluirse en la vacuna contra la influenza de la próxima temporada.

Las serologías con suero humano y las secuenciaciones genéticas aportan más información sobre la similitud de los virus en circulación con respecto a los virus de las vacunas y otros virus de la influenza.

Figura 1. Características del virus de la influenza

En la imagen de arriba se pueden ver diferentes características de un virus de la influenza, incluidas las principales proteínas de su superficie, la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). Después de una infección por influenza o de recibir la vacuna contra la influenza, el sistema inmunitario del organismo desarrolla anticuerpos que reconocen y se unen a los "sitios antigénicos", que son zonas de las proteínas en las superficies de un virus de la influenza. Al unirse a los sitios antigénicos de HA, los anticuerpos pueden neutralizar los virus de la influenza, y esto evita que vuelvan a causar una infección. (Los anticuerpos que se adhieren a los sitios antigénicos de NA también pueden reducir una mayor propagación).

La prueba de inhibición de la hemaglutinación (prueba de IH)

Los científicos usan una prueba llamada prueba de inhibición de hemaglutinación (prueba de IH) para la caracterización antigénica de los virus de la influenza. Las proteínas HA sobre la superficie de los virus de la influenza pueden adherirse a los glóbulos rojos y unirlos, formando una estructura de red (esto se conoce como "hemaglutinación"). En la imagen de abajo se puede ver un ejemplo de hemaglutinación. La sección que se encuentra sobre la derecha de la imagen muestra cómo se ve la hemaglutinación dentro de un pocillo de microvaloración (esto se explica en mayor detalle a continuación).

diagrama del virus

El procedimiento de la prueba de IH consiste en medir con qué efectividad se unen los anticuerpos a las proteínas HA y evitan que "peguen" los glóbulos rojos entre sí (es decir, inhibición de la hemaglutinación). En la imagen de abajo se puede ver un ejemplo de inhibición de la hemaglutinación. La sección sobre la derecha de la imagen muestra cómo se ve la inhibición de la hemaglutinación en un pocillo de microvaloración (esto se explica en mayor detalle a continuación).

diagrama del virus

 

Los científicos usan la prueba de IH para evaluar la similitud antigénica que existe entre los virus de la influenza. Esta prueba ayuda a elegir los virus de vacuna experimental (CVV, por sus siglas en inglés) que se incluyen en las vacunas contra la influenza estacional. Las pruebas de IH nos permiten saber si los anticuerpos desarrollados después de la vacunación con un virus reconocen, se adhieren y, por consiguiente, son similares a otros virus de la influenza en circulación.  Los científicos además usan la prueba de IH para comparar las propiedades antigénicas (es decir la capacidad de los anticuerpos de reconocer los virus) de los virus de la influenza en circulación en la actualidad contra los virus de la influenza que circularon en el pasado.

La prueba de IH involucra tres componentes principales: los anticuerpos, el virus de la influenza y los glóbulos rojos que se mezclan en los pocillos (p. ej., tazas) de una placa de microvaloración. (Ver imagen 1).

Imagen 1: Una placa de microvaloración

La prueba de IH involucra tres componentes principales: los anticuerpos, el virus de la influenza y los glóbulos rojos que se mezclan en los pocillos (p. ej., tazas) de una placa de microvaloración.

Se utiliza una placa de microvaloración para realizar la prueba de IH. La placa contiene pocillos (por ej., depresiones tipo tazas con capacidad para una pequeña cantidad de líquido) donde se colocan la solución de anticuerpos, el virus de la influenza y los glóbulos rojos para que interactúen. Estos pocillos están dispuestos en hileras y columnas (que se identifican en la placa de microvaloración mediante letras y números respectivamente). Las hileras de la placa pueden utilizarse para someter a prueba diferentes virus de la influenza contra el mismo grupo de anticuerpos. Las columnas pueden utilizarse para marcar diferencias entre diluciones mayores de anticuerpos, como una escala de menor a mayor, de izquierda a derecha (ver figuras 3 y 4 para obtener un ejemplo).

Los anticuerpos que se usan en la prueba de IH se obtienen tras infectar a un animal (por lo general, un hurón) inmunológicamente intacto (es decir, que no ha estado expuesto anteriormente a ninguno de los virus de la influenza ni a la vacuna a lo largo de su vida). El sistema inmunitario del animal genera anticuerpos en respuesta a los antígenos presentes en la superficie del virus de la influenza específico que se utilizó para infectar ese animal. Para estudiar estos anticuerpos, se toma una muestra de sangre del animal, de la que se obtiene el suero. La prueba de IH mide la capacidad de estos anticuerpos de reconocer y adherirse a otros virus de la influenza (como los virus de la influenza aislados de pacientes con influenza). Si los anticuerpos de los hurones que resultaron de la exposición al virus de la vacuna reconocen el virus de la influenza de un paciente enfermo y se adhieren a él, esto indica que el virus de la vacuna es antigénicamente similar al virus de la influenza obtenido del paciente enfermo. Este hallazgo repercute en la efectividad que puede tener la vacuna en las personas. Vea Efectividad de la vacuna contra la influenza: Preguntas y respuestas para profesionales de la salud para obtener más información.

Como mencionamos anteriormente, los virus de la influenza que se usan en la prueba de IH se obtienen de personas enfermas. Los CDC y otros centros de colaboración de la OMS recolectan muestras de personas en todo el mundo para detectar qué virus de la influenza están infectando a los seres humanos y monitorear cómo van cambiando.

Para la prueba de IH, los glóbulos rojos (RBC, por sus siglas en inglés) se extraen de animales (por lo general, pavos o conejillos de Indias). Se usan en la prueba de IH porque los virus de la influenza se unen a ellos. Por lo general, los RBC en una solución se hundirán y formarán un punto rojo en el fondo del pocillo para ensayos (figura 2A). Sin embargo, cuando se agrega un virus de la influenza a la solución de RBC, las proteínas superficiales del virus, es decir la hemaglutinina (HA), se unirán a varios RBC. Cuando los virus de la influenza se unen a los RBC, los hematíes forman una estructura reticulada (figura 2B). Esto hace que los RBC permanezcan suspendidos en la solución en lugar de asentarse en el fondo y formar el punto rojo. El proceso por el que atraviesa el virus de la influenza para unirse a los RBC y formar la estructura reticulada se denomina "hemaglutinación".

Figura 2: Componentes de un ensayo de IH.

La prueba de IH implica la interacción de glóbulos rojos (RBC), anticuerpos y virus de la influenza.

La prueba de IH implica la interacción de glóbulos rojos (RBC), anticuerpos y virus de la influenza. La hilera A muestra que ante la ausencia del virus, los RBC en una solución se hundirán y se asentarán en el fondo de un pocillo de la placa de microvaloración y tendrán la apariencia de un punto rojo. En la fila B se puede ver que los virus de la influenza se adhieren a los glóbulos rojos cuando se colocan en la misma solución. Esto se conoce como hemaglutinación y está representado por la formación de una estructura de red, que se puede ver en la columna derecha, debajo de "Resultados de microvaloración". En la fila C se puede ver que el anticuerpo se adhiere bien al virus y evita que el virus "pegue" los glóbulos rojos entre sí y formen una estructura de red, y que por consiguiente no se produce hemaglutinación (es decir, se produce la inhibición de la hemaglutinación).

Cuando los anticuerpos se mezclan previamente con el virus de la influenza seguido por los RBC, los anticuerpos se unirán a los antígenos del virus de la influenza que reconocen y lo cubrirán de modo que sus proteínas superficiales HA ya no pueden unirse a los RBC (figura 2C). La reacción entre el anticuerpo y el virus inhibe (es decir, evita) la hemaglutinación, cuya consecuencia es la inhibición de esta respuesta biológica (como se muestra en la figura 2C). Por eso la prueba se conoce como "prueba de inhibición de la hemaglutinación (IH)". La hemaglutinación (como se muestra en la figura 2B) ocurre cuando los anticuerpos no reconocen, y por consiguiente, no se adhieren a los virus de la influenza en la solución. Por lo tanto, los virus de la influenza se unen a los glóbulos rojos en la solución y forman una estructura de red. Cuando los anticuerpos sí logran reconocer los virus de la influenza y adherirse a ellos en la solución, esto demuestra que el virus de la vacuna (como el que infectó al hurón) es similar al virus de la influenza obtenido de la muestra del paciente enfermo. Cuando esto ocurre, se dice que el virus de la influenza que se analiza es "antigénicamente similar" al virus de la influenza que generó los anticuerpos (en el hurón).

Cuando un virus de la influenza en circulación es diferente antigénicamente de una vacuna, los anticuerpos que el organismo crea en respuesta al virus de la vacuna podrían no reconocer el virus y no adherirse a él. En la prueba de IH, esto producirá hemaglutinación (ver la figura 2B). Los virus de la influenza en circulación que se analizan mediante la prueba de IH por lo general se obtienen de muestras respiratorias de pacientes enfermos.

Evaluación de la similitud antigénica mediante la prueba de IH

La prueba de IH evalúa el grado de similitud antigénica entre dos virus, con una escala basada en la dilución de los anticuerpos. Como se ha mencionado anteriormente, la prueba de IH se lleva a cabo mediante el uso de una placa de microvaloración. La placa de microvaloración cuenta con hileras y columnas de pocillos (por ejemplo, tazas) en los que se mezclan los RBC, los virus de la influenza y los anticuerpos (desarrollados contra un virus modelo, como un virus de la vacuna). Las diluciones se marcan en la parte superior de la placa de microvaloración. Estas diluciones sirven de escala para evaluar la similitud antigénica y la respuesta inmunitaria. Al analizar la capacidad de mayor dilución de anticuerpos para prevenir la hemaglutinación, los científicos miden la capacidad de esos anticuerpos de reconocer un virus de la influenza y adherirse a este. A mayor dilución, menor es la cantidad de anticuerpos que se necesita para bloquear la hemaglutinación y mayor es la similitud antigénica de los dos virus en comparación. La dilución más alta de anticuerpos producto de la inhibición de la hemaglutinación del virus analizado se considera una valoración de IH (figura 3).

Figura 3: Ensayo de titulación de la IH.

Esta muestra del virus presenta una valoración de IH de 1280, lo que significa que la mayor dilución de anticuerpos que evitó que se produjera la hemaglutinación fue una dilución de 1280.

El virus tiene una valoración de IH de 1280, lo que significa que la dilución máxima de anticuerpos que bloqueó la hemaglutinación fue a una dilución de 1280. En este nivel de dilución, los anticuerpos todavía eran capaces de reconocer y unirse a los antígenos en el virus.

Figura 4: Ensayo de caracterización antigénica.

Cuando los CDC caracterizan en términos antigénicos los virus de la influenza para tomar decisiones en cuanto a la fórmula de la vacuna contra la influenza estacional, se utiliza la prueba de IH para comparar los virus que están en circulación en ese momento (B y C) con los virus de la vacuna (A).

 

Cuando los CDC caracterizan antigénicamente los virus de la influenza para basar en esta información las decisiones sobre la formulación de la vacuna contra la influenza estacional, la prueba de IH se usa para comparar los virus en circulación en la actualidad (filas B y C) con los virus de la vacuna (fila A). Esto le permite a los científicos determinar rápidamente si un virus que se incluyó en la vacuna contra la influenza estacional tiene una suficiente similitud antigénica a los virus de la influenza en circulación como para desencadenar una respuesta inmunitaria contra ellos.

Los expertos de salud pública consideran que los virus de la influenza son similares en términos antigénicos o "parecidos" entre sí si sus titulaciones de IH difieren en dos diluciones o menos. (Esto equivale a una diferencia de un pocillo doble [es decir, una dilución cuádruple] o menos). Si tomamos la figura 4 como ejemplo, cuando el virus 1 en circulación se compara con un virus de la influenza, el virus 1 en circulación difiere en una dilución (una diferencia de 2 veces) y, por lo tanto, es "similar" al virus de la vacuna de la temporada anterior. Sin embargo, el virus 2 en circulación difiere en cinco diluciones (una diferencia de 32 veces) y, por lo tanto, no es "similar" al virus de la vacuna de la temporada anterior. Los virus en circulación que no son antigénicamente similares (es decir que no son "parecidos") al panel de referencia se consideran "reactores bajos".

Limitaciones

La caracterización antigénica aporta información valiosa acerca de si la vacuna hecha con un virus específico de la vacuna protegerá contra los virus de la influenza en circulación, pero existen varias limitaciones en la metodología de prueba de la caracterización antigénica, que se describen a continuación.

No funciona con los virus recientes de la influenza A(H3N2)

Una limitación importante de la prueba de IH es que la mayoría de los virus de la influenza A(H3N2) en circulación no se adhieren a los glóbulos rojos y, por consiguiente, no se pueden analizar con la prueba de IH. Como resultado, los CDC han creado otra prueba de neutralización de virus llamada, "prueba de neutralización con base en imágenes de alto contenido" (HINT, por sus siglas en inglés) para medir cómo evolucionan los virus de la influenza A(H3N2) en circulación para evadir la inmunidad humana. Puede ver más información sobre HINT en un artículo destacado de los CDC.

Adaptaciones en huevos

En este momento, la mayoría de las vacunas contra la influenza se fabrican con virus cultivados en huevo de gallina. Debido a que los virus de la influenza humana se adaptan para crecer en los huevos, es posible que los virus experimenten cambios genéticos. Estos cambios se denominan cambios "adaptados en huevos". Algunos cambios adaptados en huevos pueden cambiar las propiedades antigénicas (o inmunogénicas) del virus mientras que otros no. Los cambios de adaptación al huevo se han vuelto un problema para la selección de los virus de vacuna experimental (CVV, por sus siglas en inglés) en el caso del componente de virus A(H3N2) de la vacuna contra la influenza que se produce mediante tecnología de cultivo en huevo. Los virus de la influenza A(H3N2) tienden a no crecer tan bien en huevos de gallina como otros virus de la influenza (como el A(H1N1)pdm09), y además son más propensos a cambiar para adaptarse al huevo. Dichos cambios pueden reducir la protección inmunitaria otorgada por la vacuna contra los virus de influenza A(H3N2) en circulación.

Periodo de tiempo desde la selección del virus de la vacuna hasta la distribución de esta

Con la tecnología de producción actual de vacunas con cultivo en huevo, la elaboración lleva unos seis meses desde el momento en que se elige un virus de la influenza (esto es en febrero para la vacuna contra la influenza para el hemisferio norte) hasta el momento en el que las vacunas contra la influenza están ampliamente disponibles. Como los virus de la influenza cambian constantemente, los virus de la influenza en circulación pueden cambiar durante este período de seis meses. Si estos cambios genéticos propician cambios antigénicos, podría significar que los anticuerpos creados a través de la vacunación no reconozcan ni neutralicen los virus de la influenza en circulación. Implementar tecnologías nuevas que acorten los tiempos de producción podría reducir las probabilidades de que se produzcan cambios antigénicos importantes en los virus en circulación antes de que las vacunas contra la influenza estén disponibles todos los años, como las tecnologías de cultivo celular y las vacunas recombinantes contra la influenza.

Uso en animales

El uso de la prueba de IH para evaluar la similitud entre los virus de la influenza en circulación y los virus de la vacuna implica la obtención de anticuerpos de animales (en especial de hurones). Por lo general, se usan hurones para replicar la infección por la influenza en animales, porque se pueden infectar fácilmente por los virus de la influenza y tener signos y síntomas similares (como fiebre, estornudos, pérdida de apetito, etc.). Antes de la infección, se analiza el suero del hurón para verificar que no contenga anticuerpos a los virus de la influenza en circulación. Cuando se infecta a los hurones con virus vivos de la influenza, por lo general producen respuestas de anticuerpos sólidas contra ese virus en particular.  Por consiguiente, es frecuente el uso de antisuero de hurones para detectar las diferencias antigénicas entre los virus de la influenza. Sin embargo, existen diferencias entre las respuestas inmunitarias de los hurones y las de los humanos, que se deben tener en cuenta al evaluar las propiedades antigénicas de los virus de la influenza. Hay más información disponible sobre el uso de suero humano en serología humana e influenza.

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