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Métodos de análisis de vigilancia de aguas residuales

Métodos de análisis de vigilancia de aguas residuales
Actualizado el 23 de nov. del 2020

Use esta guía para implementar la vigilancia de enfermedades transmitidas por aguas residuales. La vigilancia de enfermedades transmisitidas por aguas residuales es una ciencia de rápido desarrollo, y los CDC seguirán actualizando la guía y la información a medida que esté disponible.

Visión general de los métodos de análisis

Son varios los métodos de análisis y flujos de trabajo de laboratorio que se utilizan para cuantificar el SARS-CoV-2 en aguas residuales en los Estados Unidos. Los controles de laboratorio pueden garantizar que los resultados sean comparables al tener en cuenta el rendimiento de los métodos escogidos y la calidad de los datos. Con base en los niveles de SARS-CoV-2 en las aguas residuales, es posible adaptar los métodos a límites de detección más altos o más bajos según sea necesario. Por ejemplo, si los niveles de ARN del SARS-CoV-2 son lo suficientemente altos en las aguas residuales, se pueden analizar volúmenes pequeños de aguas residuales (p. ej., 1 ml) sin procesos de concentración adicionales. Los métodos de análisis incluyen los pasos para el procesamiento de las muestras, el uso de controles de laboratorio y la implementación de medidas de bioseguridad para garantizar que los datos puedan ser interpretados con fines de salud pública.

ilustración de procesamiento  y análisis de muestras de aguas residuales para detectar el SARS-CoV-2
Visión general del procesamiento y análisis de muestras de aguas residuales para detectar el SARS-CoV-2

Luego de recoger las muestras, el primer paso en el análisis de aguas residuales para detectar SARS-CoV-2 es la preparación de las muestras. Se debe agregar un control de recuperación de matriz a la muestra durante este paso. El segundo paso es la concentración de la muestra. El tercer paso es la extracción del ARN de la muestra concentrada de aguas residuales. El último paso es la medición del ARN. Además de la medición del ARN del SARS-CoV-2 en este paso, también se deben medir varios controles de laboratorio, incluidos los controles de recuperación de matriz, la normalización fecal humana, los controles de medición cuantitativa y los controles para evaluar la inhibición del método molecular.

Procesamiento de muestras

El procesamiento de muestras para medir el ARN del SARS-CoV-2 en aguas residuales implica métodos para la preparación de la muestra, concentración de la muestra, extracción del ARN y medición del ARN. Los métodos seleccionados en cada paso deben adaptarse para poder usarlos con aguas residuales, las cuales son una mezcla variable y compleja tanto químicamente como biológicamente. Evalúe el rendimiento de estos procedimientos de procesamiento de muestras de aguas residuales al utilizar controles de laboratorios adecuados. Se deben seguir los protocolos de bioseguridad adecuados para el procesamiento de muestras de aguas residuales que pueden contener SARS-CoV-2, los cuales se describen más adelante en esta página web.

Preparación de las muestras

Almacenar y preparar adecuadamente las muestras de aguas residuales ayuda a garantizar que las mediciones de ARN del SARS-CoV-2 del agua residual sean precisas.

  • Almacenamiento: refrigere las muestras a 4 °C inmediatamente después de recogerlas y, si es posible, procéselas dentro de las siguientes 24 horas para reducir la degradación del ARN del SARS-CoV-2 y mejorar la utilidad de la vigilancia. Si no puede procesar las muestras dentro de las 24 horas posteriores a su recolección, debería agregar un control de recuperación de matriz a las muestras antes de refrigerarlas a 4 °C o congelarlas a -20 °C o -70 °C. 
  • Homogeneización: tanto las muestras de aguas residuales líquidas como las muestras de lodo primario deben mezclarse bien antes de extraer porciones de las aguas residuales recogidas para su posterior procesamiento. Mézclelas al invertir las muestras varias veces (en el caso de muestras líquidas) o mediante métodos de mezclado mecánico. La homogeneización de las muestras también puede incluir procedimientos para descomponer los sólidos de las aguas residuales y desagregar las partículas de virus, por ejemplo mediante sonicación.
  • Clarificación de las muestras: clarificar las muestras líquidas de aguas residuales al eliminar los sólidos grandes puede facilitar los pasos subsiguientes de concentración por filtración si se utilizan para concentrar la muestra. No obstante, eliminar los sólidos también eliminará el ARN del SARS-CoV-2 adherido a estos sólidos. Puede clarificar las muestras usando filtros con gran tamaño de poro (5 µm o más grande) o centrifugación.

Concentración de las muestras

Concentrar las muestras de aguas residuales puede mejorar la detección del ARN del SARS-CoV-2. La concentración puede ser más importante en el caso de las muestras de aguas residuales sin tratar que en las muestras de lodo primario. Vea ¿De qué tomar muestras? dentro de "Cómo elaborar una estrategia de muestreo de aguas residuales" para obtener más información a la hora de seleccionar un tipo de muestra.

Los enfoques de concentración evaluados hasta la fecha que permiten una recuperación adecuada para la detección del SARS-CoV-2 en aguas residuales incluyen:

  • Ultrafiltración
  • Filtración mediante una membrana electronegativa con pretratamiento de la muestra a través de la incorporación de MgCl2 o acidificación
  • Precipitación con polietilenglicol (PEG)
  • Floculación de la leche desnatada
  • Ultracentrifugación

Tenga en cuenta los siguientes factores al seleccionar un método de concentración de virus:

  • Tipo de muestra: en el caso de las muestras de aguas residuales sin tratar, hay varios métodos de filtración y precipitación disponibles, los cuales se mencionan más arriba. En cuanto a las muestras de lodo primario, la centrifugación es la forma más eficaz de concentrar los sólidos.
  • Volumen de la muestra: los volúmenes grandes de muestras de aguas residuales sin tratar pueden requerir dividir la muestra antes de la filtración por membrana (debido a la baja tasa de filtración) o precipitación con PEG (debido a las limitaciones de volumen de las centrífugas). Los volúmenes de muestra superiores a 5 L pueden requerir preconcentración mediante métodos diseñados para concentrar volúmenes grandes, como la ultrafiltración con cartuchos de gran tamaño.
  • Posibles inconvenientes en la cadena de suministro: los métodos que requieren productos de filtración comercial, como filtros de membrana o cartuchos de ultrafiltración, puede ser más susceptibles a inconvenientes en la cadena de suministro que otros métodos.
  • Tiempo de procesamiento de la muestra: la selección del método de concentración se verá limitada por el tiempo de procesamiento del método y la disponibilidad de personal de laboratorio. La filtración por membrana de muestras de aguas residuales turbias puede demorar varias horas.
  • Disponibilidad de equipos de laboratorio: el volumen y la capacidad de fuerza de las centrífugas, además de la disponibilidad de unidades de filtración por membrana, también limitarán la selección del método.

Extracción del ARN

La extracción y purificación del ácido nucleico es un paso esencial para aislar el ARN del SARS-CoV-2 a partir de la mezcla de aguas residuales. Las aguas residuales son una mezcla compleja con materiales desconocidos que interfieren en los métodos moleculares de cuantificación viral, por lo que debe tener en cuenta los siguiente al seleccionar un método de extracción:

  • Seleccione un protocolo de extracción diseñado para producir extractos de ácido nucleico altamente purificados a partir de muestras ambientales. Hay kits comerciales disponibles para la extracción de muestras ambientales.
  • Use un kit de extracción o un protocolo diseñado específicamente para purificar ARN que además incluya desnaturalizantes de la ARNasa previo a la lisis.
  • Evite la degradación del ARN extraído debido a múltiples ciclos de congelación-descongelación al distribuir los extractos en alícuotas en diferentes tubos y almacenarlos a -70 °C o menos.

Medición del ARN

Métodos de detección: cuantifique el RNA del SARS-CoV-2 en las aguas residuales mediante RT-qPCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa) o RT-ddPCR (PCR o reacción en cadena de la polimerasa digital en gotas con transcriptasa inversa; también es posible utilizar otras formas de PCR digital pero son menos comunes). Cada método puede llevarse a cabo ya sea como una reacción de 1 paso, en la cual la RT y la PCR ocurren en la misma mezcla de reacción, o como una reacción de 2 pasos, en la cual la RT y la PCR se realizan en reacciones separadas secuenciales. El protocolo de RT-ddPCR de 1 paso es ventajoso en el caso de las aguas residuales porque la RT se realiza en gotas individuales, lo que puede reducir la inhibición de la RT en comparación con la RT en soluciones a granel, como en el proceso de 2 pasos y en la RT-qPCR.

Dianas genéticas: se ha notificado que los cebadores y sondas dirigidos a las regiones de los genes N (N1 y N2, publicados por los CDC) y E (E_sarbeco, Corman et al., 2020 EuroSurveillance) del SARS-CoV-2 son sensibles y específicos para cuantificar el ARN del SARS-CoV-2 en aguas residuales. Si es posible, compare las mediciones de aguas residuales usando los mismos genes de interés.

Controles de laboratorio

Los controles de laboratorio son esenciales para comparar las concentraciones de ARN del SARS-CoV-2 en aguas residuales en el tiempo y de diversas fuentes de aguas residuales, especialmente al utilizar diferentes métodos de análisis. Los CDC recomiendan los siguientes tipos de controles de laboratorio de medición para la vigilancia de aguas residuales con SARS-CoV-2:

  • Control de recuperación de la matriz
  • Normalización de los desechos fecales humanos
  • Controles de medición cuantitativa
  • Evaluación de inhibición
  • Controles negativos

Controles de recuperación de matriz

Use un control de recuperación de matriz (también denominado control de procesos) para comprender qué cantidad de virus se pierde durante el proceso de muestreo. Este control es importante para comparar las concentraciones resultantes de diferentes métodos de análisis y en el tiempo. Es importante evaluar cuantitativamente la recuperación porque las aguas residuales son variables y complejas tanto químicamente como biológicamente, y a menudo contienen componentes que interfieren en la concentración de la muestra, la extracción del ácido nucleico o los métodos moleculares de cuantificación. Debe incluir un control de recuperación de matriz en la validación del método y, si es posible, incluirlo en cada muestra para poder explicar los cambios inesperados en la composición de las aguas residuales. Incluya siempre un control de recuperación de matriz cuando las condiciones de las aguas residuales (por ejemplo, debido a la afluencia de agua de lluvia) o los métodos de laboratorio se modifiquen.

Un control de recuperación de matriz que sea biológicamente más parecido al SARS-CoV-2 podría representar con mayor exactitud la recuperación del SARS-CoV-2 a partir de la muestra de aguas residuales. Los candidatos para los controles de recuperación de matriz son virus con envoltura con genomas de ARN monocatenario, incluido el coronavirus murino (también denominado virus de la hepatitis murina), coronavirus bovino y virus sincitial respiratorio bovino.

Normalización de los desechos fecales humanos

La normalización de las concentraciones de SARS-CoV-2 en aguas residuales antes de calcular las tendencias se lleva a cabo para considerar los cambios en la dilución de las aguas residuales y las diferencias en el aporte relativo de excrementos a lo largo del tiempo. Si se espera que la cantidad de personas que contribuye al área específica de alcantarillado cambie durante el periodo de vigilancia (debido al turismo, los viajes entre semana, los trabajadores temporarios, etc.), normalizar las concentraciones de SARS-CoV-2 según la cantidad de heces humanas en las aguas residuales puede ser importante para interpretar las concentraciones de SARS-CoV-2 y comparar las concentraciones entre las muestras de aguas residuales en el tiempo. Los controles de normalización de los desechos fecales humanos son los organismos o compuestos específicos de las heces humanas que pueden medirse en las aguas residuales para estimar el contenido de desecho fecal humano.

Los controles de normalización humana incluyen, entre otros:

  • Dianas moleculares virales de indicadores fecales: virus del moteado suave del pimiento, crAssphage
  • Dianas moleculares bacterianas de indicadores fecales: Bacteroides HF183, Lachnospiraceae Lachno3

Normalizar las concentraciones de SARS-CoV-2 usando controles de desechos fecales humanos (p. ej., la proporción de SARS-CoV-2 en las concentraciones de control de desechos fecales humanos) también podría ayudar a explicar las pérdidas virales que ocurren en diferentes momentos entre el ingreso de desechos fecales al sistema de aguas residuales y la cuantificación en el laboratorio. No obstante, la normalización de los desechos fecales humanos no puede reemplazar los controles de recuperación de matriz a la hora de evaluar el rendimiento del método.

Controles de medición cuantitativa

Debe incluir controles de medición cuantitativa para todos los métodos de cuantificación de ARN del SARS-CoV-2. En el caso de la RT-qPCR, derive una curva de calibración a partir de un control de concentración conocida. En cuanto a la RT-ddPCR, incluya un control de cantidad conocida en cada ejecución del instrumento. Los controles de ARN son preferibles a los controles de ADN para obtener una cuantificación precisa del ARN de interés. Divida en alícuotas los controles de medición cuantitativa para evitar los ciclos de congelación-descongelación y almacénelos a -70 °C o menos.

Evaluación de inhibición

Use el análisis de inhibición para determinar si los procesos de cuantificación de ARN (RT y PCR) se están llevando a cabo según lo previsto. Las aguas residuales son una mezcla compleja y variable, y a menudo contienen compuestos que pueden impedir la medición precisa al interferir con los métodos de cuantificación de ARN.

La inhibición puede evaluarse al usar diversos enfoques:

  • Cuando las concentraciones de ARN de SARS-CoV-2 son altas, evalúe la inhibición al evaluar si las concentraciones medidas en el ARN extraído diluido a diferentes niveles se modifican con la dilución según lo previsto.  Se prefiere este método porque permite evaluar directamente la inhibición en la misma reacción utilizada para cuantificar el SARS-CoV-2 en la muestra.
  • Cuando las concentraciones de ARN del SARS-CoV-2 sean demasiado bajas como para poder cuantificarlas luego de la dilución, evalúe la inhibición al incorporar ARN viral (por ejemplo, ARN sintético del SARS-CoV-2 o ARN purificado de un coronavirus no humano, según lo descrito en los controles de recuperación de matriz) a los extractos de aguas residuales, y al comparar la concentración medida con el ARN viral incorporado a los negativos moleculares (controles sin plantillas) o con una dilución del extracto enriquecido.

Si detecta inhibición, a menudo puede ser eliminada mediante la dilución de los extractos. Si detecta inhibición con frecuencia, deberá optimizar los métodos de cuantificación o procesamiento de las muestras.

Controles negativos

Los blancos de extracción se hacen extrayendo ARN sin la adición de una muestra de aguas residuales. Estos controles se utilizan para detectar la contaminación del reactivo de extracción. Inclúyalos con cada juego de muestras extraído.

Los "controles sin plantillas" son reactivos de reacciones moleculares sin la incorporación del extracto de ácido nucleico de la muestra de aguas residuales. Use estos controles para detectar la contaminación de los reactivos moleculares e inclúyalos en todas las ejecuciones de instrumentos PCR.

Bioseguridad

La concentración de SARS-CoV-2 a partir de aguas residuales requiere procesos que generan bioaerosoles. Los CDC recomiendan llevar a cabo estos procesos en un establecimiento con Nivel de Bioseguridad 2 (BSL2) con flujo de aire unidireccional y precauciones BSL3, lo que incluye protección respiratoria y un área designada para ponerse y quitarse el equipo de protección personal. Los desechos de laboratorio provenientes de las muestras de aguas residuales que podrían contener SARS-CoV-2 deben someterse al proceso de autoclave y ser manejados de conformidad con las directrices de bioseguridad BSL2.

Pasteurización

Se ha llevado a cabo la pasteurización por calor de las muestras de aguas residuales para reducir el riesgo de bioseguridad de los procesos que generan bioaerosoles durante el procesamiento de muestras de aguas residuales. Considere lo siguiente al decidir si incluirá el proceso de pasteurización:

  • Se desconoce en qué medida la pasteurización por calor dañará los fragmentos cortos de ARN que son objeto de la PCR.
  • Los informes revisados por pares han establecido que el tratamiento térmico de las muestras respiratorias a 56 ºC por 30 minutos provoca un cambio insignificante en la medición de ARN.
  • Algunos investigadores han informado que el tratamiento térmico de aguas residuales a 60 ºC puede mejorar la medición de ARN del SARS-CoV-2, pero se necesitan más datos para confirmar este efecto.